乾隆五十一年（1786年）時發生林爽文事件，後來清廷派遣派陝甘總督大學士福康安與參贊大臣海蘭察於鹿港登陸台灣，後來順利逮捕林爽文。所以乾隆帝就令福康安興建該廟，並下詔封媽祖為「護國庇民妙靈昭應宏仁普濟福佑群生誠感咸孚顯神贊順天后」。被命名為「新祖宮」是要與鹿港另一個原來就已經存在的媽祖廟「舊祖宮」─鹿港天后宮作為對比，此外，鹿港另有第三間媽祖廟興安宮，是三間媽祖廟之中年代最久的。該廟後來於嘉慶十一年（1806年）及道光十四年（1834年）兩度重修，於台灣日治時期因戰爭遭炮火破壞，至1970年再度重修。

新祖宮中祭祀的媽祖神像為「軟身媽」，意即雖然頭手頸是木雕，但是身體是藤編，所以可以轉動手腳換穿衣服。另外，於媽祖兩旁的副神「金將軍千里眼」與「柳將軍順風耳」的神像為穿著清代官方正式服裝，是比較特別之處。由於是官廟，所以在清領時期時，每個月都會有官員負責祭祀。目前該廟保存有乾隆五十三年（1788年）的「敕建天后宮碑記」、乾隆五十七年（1792年）的「天后宮田產碑記」、嘉慶十一年（1806年）的「重修廟宇碑記」與道光十四年（1834年）的「重修天后宮碑記」等等四塊碑石，造成「鹿港八景」中的「新宮讀碑」。